小鼠肝微粒体活性测定与保存方法

　　小鼠肝微粒体是体外药物代谢、酶活性研究的核心生物材料，其活性稳定性直接决定实验结果的可靠性。以下是肝微粒体活性测定的关键方法和标准化保存流程，步骤清晰、可操作性强。
 

　　一、 小鼠肝微粒体活性测定(以 CYP450 酶活性为例)
 

　　CYP450 酶是肝微粒体中负责药物代谢的核心酶系，常用对硝基苯甲醚(PNOD)脱甲基反应测定 CYP1A2 活性，作为肝微粒体活性评价的指标。
 

　　1. 试剂与耗材准备
 

　　缓冲液：0.1mol/L 磷酸钾缓冲液(pH 7.4)、10mmol/L PNOD 底物溶液(甲醇溶解)、10mmol/L NADPH 再生系统(含 NADPH、葡萄糖 - 6 - 磷酸、葡萄糖 - 6 - 磷酸脱氢酶)
 

　　器材：低温离心机、酶标仪、恒温水浴锅、EP 管、移液枪
 

　　2. 活性测定操作步骤
 

　　反应体系配制(总体积 200μL，冰上操作)


 

　　空白对照组：用缓冲液替代肝微粒体蛋白液。
 

　　孵育反应
 

　　37℃恒温水浴孵育 30min，精准控制时间。
 

　　加入 50μL 1mol/L 盐酸终止反应。
 

　　产物检测
 

　　加入 150μL 1mol/L 氢氧化钠溶液，振荡混匀，室温静置 10min。
 

　　酶标仪 405nm 波长下测定吸光度值(OD 值)，根据对硝基苯酚标准曲线计算产物生成量。
 

　　活性计算
 

　　酶活性单位定义：每分钟生成 1nmol 对硝基苯酚所需的酶量为 1 个活性单位(U)。
 

　　公式：酶活性(U/mg 蛋白)= 产物生成量(nmol)÷ 孵育时间(min)÷ 蛋白浓度(mg/mL)
 

　　3. 其他活性指标测定
 

　　葡萄糖醛酸转移酶(UGT)活性：以 4 - 甲基伞形酮为底物，测定荧光产物生成量。
 

　　谷胱甘肽 S - 转移酶(GST)活性：以 1 - 氯 - 2,4 - 二硝基苯为底物，检测 340nm 处吸光度变化。
 

　　二、 小鼠肝微粒体的保存方法
 

　　肝微粒体易失活，需严格控制保存条件，核心原则是低温、避光、防反复冻融。
 

　　1. 短期保存(≤7 天)
 

　　新鲜制备的肝微粒体蛋白液，用磷酸钾缓冲液调整蛋白浓度至 10-20mg/mL。
 

　　分装为 50-100μL / 管(避免反复冻融)，置于 **-20℃冰箱 ** 保存。
 

　　适用场景：短期内需完成的实验，保存期间活性会缓慢下降，建议 7 天内用完。
 

　　2. 长期保存(数月至数年)
 

　　添加保护剂：在肝微粒体蛋白液中加入终浓度 10%-20% 的甘油(分析纯)，充分混匀，甘油可降低冰点，保护酶结构。
 

　　分装冻存：按单次实验用量分装至无菌 EP 管，管内避免留气泡，密封管口。
 

　　梯度降温冻存
 

　　先置于 4℃冰箱 30min，再转移至 - 80℃超低温冰箱，避免温度骤降导致蛋白变性。
 

　　有条件的可使用程序降温盒，降温速率控制在 - 1℃/min，冻存效果更佳。
 

　　液氮保存：若需保存数年，可将分装后的肝微粒体转移至液氮罐(-196℃)，酶活性几乎无损失，适合珍贵样品。
 

　　3. 冻存后复苏与使用要点
 

　　复苏：从低温冰箱取出后，立即置于 37℃水浴锅中快速解冻，轻轻颠倒混匀，避免剧烈振荡。
 

　　解冻后处理：解冻后的肝微粒体需在冰上放置，1h 内完成实验；严禁反复冻融，否则酶活性会急剧下降(冻融 1 次活性损失可达 30% 以上)。
 

　　活性验证：长期保存的肝微粒体，使用前需重新测定酶活性，确保活性满足实验要求。
 

　　三、 注意事项
 

　　活性测定全程需冰上操作，防止肝微粒体在室温下失活。
 

　　蛋白浓度测定建议用 BCA 法，避免考马斯亮蓝法对酶活性的干扰。
 

　　保存时需在管身标注制备日期、蛋白浓度、活性值，便于后续取用。
 

　　长期保存的肝微粒体，应避免频繁开关冰箱门，减少温度波动。