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IPHASE/汇智和源 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验热点问题解答【上】

更新时间:2023-11-03      点击次数:427

体外哺乳动物细胞染色体畸变试验常见问题与解答

—热点问题—


第一题    细胞被“黑胶虫"污染了该如何处理?

如果培养的细胞被“黑胶虫"污染,需先去评估污染的严重程度。如果污染不严重,可选用市售的“黑胶虫"清除试剂进行处理;如果污染较严重,建议直接丢弃该细胞,分析造成“黑胶虫"污染的原因并进行治理。


第二题    CHL细胞为试验系统,细胞准备时推荐的接种密度是多大?接种后培养多久可以开始染毒?

本公司使用T25瓶进行试验,接种密度为6~9×10^4/mL,接种量为5mL,即每瓶细胞量是3×10^5个~4.5×10^5个。一般情况下,接种后24h左右细胞的融合率可达到80%即可进行染毒,如果融合率不够,也可以继续培养直至满足试验需求。


第三题    一般如何确定秋水仙素的浓度和处理时间啊?

秋水仙素剂量大,则作用时间短;秋水仙素剂量小,则适当延长作用时间。本公司使用的秋水仙素浓度是1μg/mL,4h。


第四题    秋水仙素工作的机理是什么?

秋水仙素可以抑制纺锤体的形成,导致纺锤丝无法捕捉到着丝粒而造成染色体不能向细胞两极移动。同时,秋水仙素处理后,染色体将会不能排列在赤道板,所以在细胞中会散乱分布。


第五题    细胞收集量少是什么原因导致的?如何优化?

细胞收集量少的原因主要有以下几点:

(1)酶消化过程消化不干净;

(2)离心速度过低,细胞不能沉淀,导致细胞丢失;

(3)铺板细胞量不够;

(4)样品对细胞有毒性,细胞死亡。


优化策略:

(1)酶消化过程需于显微镜下观察,确保消化完;

(2)适宜的离心条件,通常250g,5min;

(3)细胞悬液需混合均匀,必要时多次计数;

(4)如有需求,请于正式试验前开展预试验。


第六题    低渗目的是什么?有什么注意事项?

在低渗环境中,细胞易吸水膨胀,染色体铺展,以便能在一个平面上观察所有染色体形态,为后续染色做准备。在低渗过程中我们需要注意以下几点:


(1)低渗时间。低渗时间过长,可引起细胞破裂,染色体丢失;低渗时间不足,细胞膨胀度不够,染色体聚集,分散不好,不利于阅片。本公司低渗是使用0.075mol/L的氯化甲溶液37℃水浴30~40min。

(2) 细胞操作需轻柔。低渗后的细胞会胀大,通透性增强,细胞操作过程一定要轻柔,以防细胞破裂。

(3)离心条件需适合。低渗后细胞膨胀,离心力过高,细胞容易破裂,导致染色体丢失;离心力过低,细胞不能沉淀,收集不到细胞。


第七题    细胞在固定过程中丢失是什么原因导致的?

细胞在固定过程中丢失可能是因为离心速度过低,细胞不能沉淀或沉淀不够,在更换固定液的过程中导致细胞丢失。


第八题    每次固定的时间是多久?固定几次比较合适?

本公司使用的是预固定加重复固定的方法。预固定在低渗结束前进行,一般3~5min,步骤虽简单却不能省略,可有效预防细胞因加入大量的固定液而凝结成块。固定步骤共重复3次,一般30±5min。


第九题    玻片干燥怎么操作?

可于室温下自然干燥,也可于37℃干燥箱中烘干。


第十题    使用吉姆萨染液同样条件下染片,为什么会出现有的片子是蓝色的,有的是红色的?

根本原因是因为染色过程中pH的变化。吉姆萨染液由天青,伊红组成,所带电荷随溶液PH而定。在偏酸性环境中下在电荷增多易与伊红结合染色偏红;在偏碱性环境中负电荷增多,易与美蓝或天青结合,染色偏蓝。


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