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外周血单个核细胞(PBMC)制备方法及注意事项

发布时间:2021-03-01      点击次数:209

外周血单个核细胞(PBMC)制备方法及注意事项

外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC),是指外周血中具有单个核的细胞,包括淋巴细胞(Lymphocyte)、单核细胞(Monocyte)、树突状细胞(DC)和其他少量细胞。PBMC可利用健康人或动物供体的外周血,通过Ficoll密度梯度离心,磁珠分选等步骤获得,主要包括淋巴细胞和单核细胞。

Ficoll是蔗糖的多聚体,中性,平均分子量400,000,当密度为1.2g/mL,未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大,离心后沉于管底;淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重,离心后漂浮于分层液的液面上,也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞,就可从外周血中分离到单个核细胞。
 
人PBMC中不同细胞类型的比例
PBMC中大部分都是淋巴细胞,包括B细胞和T细胞,其中CD3+T细胞又占了淋巴细胞中绝大部分(45-70%)。这些T细胞都处于初始(naive)状态,即已经成熟了但没有受到抗原刺激。 在正常人中,只有非常小的一部分初始T细胞会因抗原识别而被激活。同样的B细胞也都处于初始状态。相对于淋巴细胞,单核细胞的比例在10-30%,收到刺激之后会发育成树突状细胞(DC)或巨噬细胞。干细胞的比例非常低,只有0.1-0.2%,因此很难从全血样本中分离到。
一、外周血单个核细胞(PBMC)制备方法
1.设备与试剂
全血 (以10ml为例)
无菌PBS溶液(pH7.4) 或者生理盐水
蔗糖溶液(Ficoll Pague PLUS) (GE Healthcare Life Sciences #17-1440-02)
RPMI 1640培养基 (Invitrogen)
胎牛血清(FBS)(GIBCO)
双抗P/S (Penicillin/ Streptomycin) (GIBCO)
二甲亚砜(DMSO)(SIGMA)
预先装好异丙醇的冻存盒

2.方法/步骤
配制所需的溶液:
a. 细胞培养基:RPMI 1640+10% FBS+1% P/S;
b. 细胞冻存液:FBS中加入10%DMSO;

(1)在离心管中加入淋巴细胞分离液Ficoll
(2)取抗凝外周血(全血)与无菌PBS按照1:1充分混匀,用移液管沿管壁缓慢叠加于分层液面上,动作一定要轻,注意保持清楚的界面。外周血,PBS,淋巴细胞分离液终体积比为1:1:1。
(3)水平离心400g×30分钟(可根据淋巴细胞分离液Ficoll或离心机转子要求调整)
(4)离心后可看见管内分为三层,上层为血浆和PBS,下层主要为红细胞和粒细胞,中层为淋巴细胞分离液。在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带,主要就是单个核细胞,包括淋巴细胞与单核细胞。此外,还含有血小板。
(5)去除部分上层液体,余下约1mL,用移液器插到云雾层,吸取单个核细胞。置入另一离心管中,加入5倍以上体积的PBS,离心300g×10分钟,洗涤细胞两次。
(6)末次离心后,弃上清,加入红细胞裂解液,室温孵育2分钟,裂解红细胞,可根据情况适当增减时间。
(7)加入10mLPBS,离心300g×10分钟,洗涤细胞两次。
(8)末次离心后,弃上清,加入含有10%FBS的RPMI1640,重悬细胞,计数,计算细胞活力。

注意事项
全血溶液可以加在Ficoll上层或者下层,但是终都必须保证两种溶液分层清晰。
分离PBMC离心的时候,一定不能设置低水平的制动。否则将分层混乱。

细胞运输与保存
(1)干冰运输,收到细胞后立即转入液氮冻存或直接复苏;
(2)T25瓶运输细胞,收到后应继续生长,传代达到细胞生长状态良好时,再进行冻存,具体操作步骤见细胞培养步骤。

PBMC收到后注意事项:
(1)收到PBMC细胞后首先观察细胞瓶是否完好,培养液是否有漏液、浑浊等现象,若有上述现象发生请及时反馈。
(2)先不打开瓶盖,瓶身擦拭酒精后放培养箱静置四小时,稳定细胞状态,切忌在温箱内静置过夜。
(3)静置后镜检,拍照,记录细胞状态。建议传代后也拍照记录细胞生长情况。
(4)贴壁细胞:若细胞密度超过80%,可正常传代;若未超过80%,收集细胞瓶内的培养基,留8ml继续培养至80%左右再传代,瓶盖可稍微拧松。
(5)细胞瓶内的培养基含血清和双抗,可收集后4℃保存备用,可补加2%血清。刚开始传代时建议一半用细胞瓶内的培养基,一半用自备的培养基,使细胞逐渐适应培养条件,以免因不适应而造成生长状态不佳。
(6)细胞胰酶消化液建议使用PBS配制。

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不同种属PBMC:人,猴,犬,大鼠,小鼠

货号    产品    状态
0621011/0621012    人外周血单个核细胞PBMC    Fresh/Frozen
0621021/0621022    猴外周血单个核细胞PBMC    Fresh/Frozen
0621031/0621032    比格犬外周血单个核细胞PBMC    Fresh/Frozen
0621041/0621042    大鼠外周血单个核细胞PBMC    Fresh/Frozen
0621051/0621052    小鼠外周血单个核细胞PBMC    Fresh/Frozen
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