N-亚硝胺类化合物的遗传毒检测——Enhanced Ames Test

关键词：N-Nitrosamines，NDSRIs，N-亚硝胺，OECD 471，Enhanced Ames test，增强型Ames，Mutation Test，Induced Hamster Liver S9, 诱导仓鼠肝S9，诱导金黄地鼠肝S9，CYP450

细菌回复突变试验，又称Ames试验，是一种广泛用于检测化合物诱变潜力的毒理试验。尽管其是验证化合物致突变作用的基石，但在评估一些需要复杂代谢激活的化合物时[如N-亚硝胺(N-Nitrosamines, NDSRIs)]，标准的Ames试验表现出了明显的局限性，因此，在OECD 471导则下增强Ames（Enhanced Ames）应运而生。

一、N-亚硝胺的基本概念

N-亚硝胺类杂质(NDSRIs)是一类分子中含有N-亚硝基结构的化合物（N-nitrosamines），含有亚硝基官能团，结构式一般为R1（R2）N-N=O。该类化合物常以痕量存在于自然界和食品中，包含空气、水、食物等各种生物生存所依赖的介质中，因此药物的制备和生产过程中不可避免地引入该类物质。但多种N-亚硝胺物质已表现出明确的基因毒性，会造成DNA损伤并进一步发展成癌症，且极低地剂量暴露也会导致相同结果。

O-亚硝胺的遗传毒性往往不依赖于其药物本身，而是其活化后的代谢产物具有致癌性。N-亚硝胺的遗传毒性机制为：代谢活化（CYP450）→ 生成烷化剂（CH₃⁺）→ DNA加合物（O⁶-MeG）→ G→A突变 → 癌基因激活/抑癌基因失活 → 癌症。

(1)      代谢活化：N-亚硝胺化合物先经细胞色素P450（如CYP2E1）代谢活化，生成具有高度反应活性的烷化中间体（如重氮烷、碳正离子），以下为以NDMA为例的经典代谢途径：

(2)      DNA烷基化：活性中间体（如CH3+）攻击DNA碱基，形成DNA加合物，主要靶点包括

O⁶-甲基鸟嘌呤（O⁶-MeG）（最-具致突变性）、N⁷-甲基鸟嘌呤（N⁷-MeG）（较常见但修复较快）和N³-甲基腺嘌呤（N³-MeA），其中O⁶-甲基鸟嘌呤（O⁶-MeG）是关键损伤。即在DNA复制时，O⁶-甲基鸟嘌呤倾向于与胸腺嘧啶（T）配对（而非正常的胞嘧啶），导致了G→A突变（点突变），若该过程未被修复，则可引发RAS、TP53等关键基因突变，从而促进癌症发生。

目前，国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer，IARC）已将多种N0亚硝胺化合物列为致癌物，其中N-二甲基亚硝胺（N-dimethylnitrosamine，NDMA）和N-亚硝基二乙胺（N-diethylnitrosamine，NDEA）被列入2A类致癌物，其他几种药物归为2B类致癌物。且根据国际人用药品注册技术要求协调理事会（International Coucil for Harmonization of Technical Requirement for Pharmaceuticals for Human Use，ICH）M7指南指出亚硝胺类药物相关杂质（N-Nitrosamine Drug Substance Related Impurities, NDSRI）是一类在药物中可能存在的亚硝胺类致癌杂质，具有高度致癌性，被归为I类杂质，需要严格控制。因此，对N-亚硝胺类化合物进行合理的遗传毒性试验是非常必要的。

二、增强Ames试验（Enhanced Ames Test）

作为金标准的经典Ames试验，在面对某些N-亚硝胺（如NDMA）时也会出现灵敏度低、伴有假阴性结果的可能性。这是因为标准Ames Test具有一定的局限性，如代谢活化系统CYP酶表达不强、突变谱检测有限等问题，因此EMA“Questions and answers for marketing authorisation holders/applicants on the CHMP Opinion for the Article 5(3) of Regulation (EC) No 726/2004 referral on nitrosamine impurities in human medicinal product（EMA Q&As指南）"中指出针对某些N-亚硝胺的Ames检测应遵循FDA国家毒理学研究中心提供的增强Ames（Enhanced Ames Test）试验条件进行验证。该指导对菌株选择、试验方法、活化系统、阴性/阳性/溶剂对照等均提出了新标准。

菌株选择

要求：鼠伤寒沙门氏菌TA98, TA100, TA1535,TA1537；埃希氏大肠杆菌WP2 uvrA（pKM101）

试验方法

要求：预保温和非平板掺入法

预保温时间

要求：30 min

S9种类、浓度

要求：30%诱导大鼠肝S9和30%诱导仓鼠肝S9（Induced Hamster Liver S9）或诱导金黄地鼠肝S9（Induced Hamster Liver S9）

阴性/溶剂对照

要求：水；有机溶剂：如乙腈、甲醇和二甲基亚砜（DMSO）

阳性对照

要求：+S9：NDMA、1-环戊基-4-亚硝基哌-嗪、NDSRI

其中诱导金黄地鼠肝S9（Induced Hamster Liver S9）或诱导仓鼠肝S9（Induced Hamster Liver S9）制备方法及流程与大鼠肝S9一致，均采用苯-巴比-妥钠和β-萘黄酮联合诱导并进一步分离所得，其活性检测也与大鼠肝S9结果相一致，但因其含有不同的CYP活性，所以是EMA建议的另一种代谢活化系统。

三、IPHASE 产品

综上所述，针对不同药物需进行的试验也略有不同，IPHASE作为体外研究生物试剂引-领者，为满足不同化合物的研究需求，减少客户的试剂、菌株制备过程，不仅可为客户提供一站式标准Ames试验多规格试剂盒，更可为客户提供增强Ames的相应试剂和菌株，致力于为客户节省成本、节约时间，提高试验可重复性。

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