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彗星试验需要注意的事项

更新时间:2023-02-09      点击次数:781
   彗星试验也称单细胞凝胶电泳试验,是一种有效评估DNA损伤的方法。
  其原理是器官或组织经处理(如辐射、重金属等)后,细胞中的DNA发生单链或双链断裂,经细胞及其核膜裂解后,DNA解旋,在电场作用下,DNA 断片迁移出细胞核,形成彗星状的电泳图谱。正常细胞的大分子DNA在电场作用下迁移距离较短,DNA仍保留在细胞核的范围,形成圆形或轻微拖尾的图谱。根据电泳缓冲液的pH值不同,可分为中性彗星实验(pH=8.4)和碱性彗星实验(pH>13)。中性彗星实验主要用于检测DNA双链的断裂损伤,碱性彗星实验具有更高的灵敏性,可用于检测更少量的单链和双链断裂损伤。
  需要注意的是:
  1、细胞一定要消化成单个的,如果待测的细胞是悬浮生长的,或者形状是圆形的,可以直接用细胞刮收细胞做,如果细胞是非圆形的,例如成纤维细胞等,一定要用胰酶消化,使之成圆形,然后才可做实验。很多做彗星实验总是出不来结果的,可以考虑下是否是这方面的原因。
  2、细胞裂解:裂解条件也是一个关键变量,可能会干扰特定类型的DNA修饰(某些DNA烷基化和碱基内收)导致的链断裂。因此建议在实验中对所有玻片的裂解条件尽可能保持恒定。准备好后,应在约2-8摄氏度的弱光条件下(如黄光(或防光),将载玻片浸入冷冻溶解液中至少1小时(或过夜),以避免暴露在可能含有紫外线成分的白光下。在此潜伏期之后,在碱液展开步骤之前,应冲洗载玻片以除去残留的洗涤剂和盐。这可以用纯净水、中和缓冲液或磷酸盐缓冲液来完成。
  3、电泳时,电流与电压强度在每次实验时要恒定,这样出来的慧尾才有分析价值,将载玻片随机放置在含有足够电泳溶液的潜电泳装置的平台上,使载玻片表面全部覆盖(每次覆盖的深度也应一致)。
  4、玻片准备:单细胞悬液制备后,应尽快(最好在1小时内)制备载玻片,但动物死亡与载玻片制备之间的温度和时间应严格控制,并在实验室条件下进行验证。
  5、掉胶的问题:盖玻片最好两面都涂上剥离硅烷(挺便宜的一大瓶,但是有毒),这样会好很多
  6、电泳胶使用时需提前水浴融化,禁用微波,清洗玻片时注意不要直接将液体倾倒至胶面,防止脱胶。
  7、使用组织进行彗星试验时,需注意细胞制备需全程在冰上进行,且保证在1小时内完成铺片。
  8、测量方法:彗星应该使用自动化或半自动化的图像分析系统进行定量评分。用合适的荧光染色剂对载玻片进行染色,并在配备有超荧光和适当检测器的显微镜或数码相机上进行适当放大(如200x)的测量。
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