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细胞的冻融要经历什么流程

发布时间:2022-08-05      点击次数:259
  冷冻保护剂添加了冷冻保护剂的冻存液,一般都是高渗透压的。当细胞从生理溶液转移到低温保存溶液时,由于胞外溶液中的渗透压较高,细胞会脱水,同时低温保存溶液的小分子扩散到细胞内时,细胞体积会缓慢减少;如果冷冻保存液中只有非穿透性冷冻保护剂(如葡聚糖和蔗糖),细胞也会脱水并保持脱水状态,只是冷冻保护剂不能进入细胞内。在解冻复苏阶段,水从细胞外的低渗溶液迅速移动到细胞内的高渗透溶液,而小分子冷冻保护剂则向相反的方向缓慢移动,导致细胞体积膨胀,并达到细胞内外的渗透压恢复平衡。所以,在细胞冷冻处理和解冻复苏的过程中,稍有差错,细胞就会因为渗透压的过度变化,导致细胞膜破裂而死亡。这就是细胞的渗透压力性损伤。
  细胞冻存和复苏采取“慢冻快融”的原则,慢速冷冻可使细胞内的水份渗出细胞外,减少细胞内形成冰晶的机会,快融以保证细胞外结晶快速融化,避免慢速融化水份渗入细胞内,再次形成胞内冰晶造成对细胞的损伤。
  (一)细胞冻存
  配制含10%DMSO或甘油的细胞冻存液,4℃预冷(新鲜配制的冻存液会产生大量的热);
  取对数生长期的细胞,用细胞消化酶将单层生长的细胞消化下来;悬浮细胞则直接将细胞收集到离心管中;
  离心1200rpm,6 min;
  去除上清液,逐渐加入适量预冷的细胞冻存液,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,计数,调节冻存液中的细胞终浓度为5×10e6/ml~1×10e7/ml;
  将细胞分装入冻存管中,每管1~1.5ml;
  在冻存管上标明细胞的名称、冻存时间及操作人员姓名;
  冻存:标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/min;到达-80℃时,则可迅速放入液氮中。
  (二)细胞复苏
  佩戴眼镜和手套,从液氮中取出冻存的细胞管。
  迅速放入38℃水浴中,并不时摇动,在1分钟内使其完全融化,然后在无菌条件下取出细胞。
  1200rpm/min离心5-10min,弃去上清,加入适量培养液混匀后接种于培养瓶中,次日更换一次培养液。
  解冻后洗涤是去除冷冻保护剂最常见的方法,即对细胞进行洗涤液或培养液重悬后离心,去除上清液,然后将细胞重新悬浮在洗涤液或培养液中。然而,需要注意的是,解冻后洗涤会造成冻存细胞的数量损失。
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